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詳細(xì)介紹一下蛋白穩(wěn)定性分析儀的工作原理
點(diǎn)擊次數(shù)：72 更新時(shí)間：2026-02-01
蛋白穩(wěn)定性分析儀核心是通過多種光學(xué)檢測(cè)技術(shù)，在溫度/化學(xué)梯度下同步監(jiān)測(cè)蛋白構(gòu)象、聚集與粒徑變化，輸出Tm、Tagg、粒徑等關(guān)鍵參數(shù)，核心技術(shù)以無標(biāo)記內(nèi)源熒光（nanoDSF/ifDSF）為基礎(chǔ)，常整合SLS、DLS等多模塊實(shí)現(xiàn)多維度表征。以下從核心技術(shù)、模塊協(xié)同、實(shí)驗(yàn)流程與數(shù)據(jù)解析四方面詳細(xì)說明：
一、核心檢測(cè)技術(shù)與原理
1.內(nèi)源差示掃描熒光（nanoDSF/ifDSF）—構(gòu)象穩(wěn)定性核心
這是無標(biāo)記檢測(cè)蛋白熱/化學(xué)變性的主流技術(shù)，無需添加染料，適配各類蛋白與緩沖體系。
激發(fā)與信號(hào)源：以280nm紫外光激發(fā)蛋白中色氨酸、酪氨酸，二者熒光特性隨微環(huán)境改變而變化。
變性信號(hào)變化：蛋白天然構(gòu)象中色氨酸位于疏水核心，熒光峰約330nm；變性時(shí)暴露到親水環(huán)境，峰位移至350nm，儀器實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)330nm/350nm熒光比值變化。
關(guān)鍵參數(shù)輸出：
熔解溫度（Tm）：熒光比值突變對(duì)應(yīng)的溫度，反映50%蛋白去折疊的溫度。
起始變性溫度（Tonset）：構(gòu)象開始變化的溫度，提示早期穩(wěn)定性臨界點(diǎn)。
化學(xué)變性濃度（Cm）：化學(xué)變性劑（如尿素）誘導(dǎo)50%變性的濃度，表征化學(xué)穩(wěn)定性。
2.靜態(tài)光散射（SLS）—聚集行為監(jiān)測(cè)
聚焦蛋白聚集起始與程度，通過散射光強(qiáng)度關(guān)聯(lián)分子量變化。
原理：激光照射樣品，蛋白聚集時(shí)粒子尺寸與分子量增大，散射光強(qiáng)度成正比上升。
關(guān)鍵參數(shù)：聚集起始溫度（Tagg），即散射光強(qiáng)度顯著上升的溫度，區(qū)分單純構(gòu)象去折疊與聚集路徑。
優(yōu)勢(shì)：可量化聚集程度，適配低濃度樣品早期聚集檢測(cè)。
3.動(dòng)態(tài)光散射（DLS）—膠體穩(wěn)定性與粒徑分析
用于檢測(cè)蛋白粒徑分布與膠體穩(wěn)定性，反映分子間相互作用與聚集動(dòng)力學(xué)。
原理：基于布朗運(yùn)動(dòng)，散射光強(qiáng)度隨粒子運(yùn)動(dòng)產(chǎn)生波動(dòng)，通過波動(dòng)頻率計(jì)算流體力學(xué)粒徑（Rh）及分布。
核心應(yīng)用：
監(jiān)測(cè)升溫/恒溫過程中粒徑增長與多分散性變化，區(qū)分單體、寡聚體與大聚集體。
計(jì)算第二維里系數(shù)（B22）、擴(kuò)散相互作用參數(shù)（kd），量化蛋白間凈相互作用（吸引/排斥），預(yù)測(cè)長期聚集傾向。
4.背反射（Backreflection）—大聚集體快速篩查
部分機(jī)型（如PrometheusPanta）搭載此模塊，通過可見光散射衰減檢測(cè)粒徑>25nm的大聚集體，抗樣品缺陷干擾，適合快速聚集篩查。
二、儀器模塊協(xié)同工作流程
現(xiàn)代分析儀多為多模塊集成，典型流程如下：
樣品準(zhǔn)備：將蛋白樣品（通常5-20μL，濃度0.05-10mg/mL）加入石英毛細(xì)管/96孔石英板，確保密封防蒸發(fā)。
梯度設(shè)置：設(shè)定溫度梯度（如25-95℃，升溫速率0.1-5℃/min）或化學(xué)變性劑梯度（如尿素濃度0-8M）。
同步檢測(cè)：
熒光模塊：持續(xù)掃描330nm/350nm熒光比值，繪制構(gòu)象變化曲線。
SLS模塊：實(shí)時(shí)記錄散射光強(qiáng)度，捕捉Tagg。
DLS模塊：同步采集散射光波動(dòng)，計(jì)算Rh與粒徑分布。
數(shù)據(jù)采集：軟件同步整合多模塊信號(hào)，生成時(shí)間-溫度-信號(hào)三維數(shù)據(jù)矩陣。
三、數(shù)據(jù)解析與核心參數(shù)
以熱穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)為例，數(shù)據(jù)處理流程如下：
熒光曲線擬合：對(duì)330nm/350nm比值-溫度曲線求導(dǎo)，導(dǎo)數(shù)峰值對(duì)應(yīng)Tm，曲線起始拐點(diǎn)為Tonset。
SLS信號(hào)閾值：設(shè)定散射光強(qiáng)度基線+3倍標(biāo)準(zhǔn)差為閾值，對(duì)應(yīng)溫度為Tagg。
DLS粒徑分析：輸出不同溫度下的平均粒徑、多分散指數(shù)（PDI），判斷聚集類型（如單體→二聚體→大聚集體）。
綜合判讀：Tm低但Tagg高提示構(gòu)象易變但不易聚集；Tm高但Tagg低提示構(gòu)象穩(wěn)定但易聚集，為配方優(yōu)化提供方向。
四、典型應(yīng)用場(chǎng)景與優(yōu)勢(shì)
藥物研發(fā)：蛋白藥物配方篩選（pH、緩沖液、添加劑優(yōu)化），候選分子穩(wěn)定性排序，配體結(jié)合親和力評(píng)估（結(jié)合后Tm升高提示穩(wěn)定）。
質(zhì)量控制：生物藥批次間穩(wěn)定性一致性檢測(cè)，加速老化實(shí)驗(yàn)預(yù)測(cè)長期儲(chǔ)存穩(wěn)定性。
基礎(chǔ)研究：蛋白突變體穩(wěn)定性分析，折疊機(jī)制研究，蛋白-蛋白/蛋白-小分子相互作用表征。
技術(shù)優(yōu)勢(shì)：無標(biāo)記、低樣品量、高通量（96/384孔）、多參數(shù)同步獲取，縮短實(shí)驗(yàn)周期并降低成本。
總結(jié)來看，蛋白穩(wěn)定性分析儀通過光學(xué)技術(shù)組合，實(shí)現(xiàn)從構(gòu)象到聚集、從熱穩(wěn)定到膠體穩(wěn)定的全維度表征，是生物藥研發(fā)、質(zhì)檢與基礎(chǔ)研究的核心工具。
