樣本質量對熒光定量檢測有哪些影響?
點擊次數：33 更新時間：2025-07-31
樣本質量是熒光定量檢測（如qPCR、熒光定量免疫分析等）結果準確性的根基，其影響貫穿從核酸/蛋白提取到最終信號讀取的全流程，核心問題集中在干擾檢測體系、引入假陽性/假陰性或導致數據失真。具體影響及機制如下：
一、樣本采集與保存不當：破壞目標物質穩定性
樣本從采集到處理的每一步操作失誤，都會直接影響目標分析物（核酸、蛋白等）的完整性或濃度。
降解問題：
核酸樣本（如血液、組織）若未及時冷藏或添加穩定劑（如EDTA、RNA保存液），會因核酸酶（DNase、RNase）活性激活導致DNA/RNA斷裂，qPCR中可能因引物無法有效結合而出現擴增效率下降，Ct值偏大甚至無擴增。
蛋白樣本若反復凍融或高溫保存，會因變性聚集失去抗原性，導致熒光免疫檢測中抗體結合效率降低，信號強度偏低。
濃度偏差：
采集量不足（如血清量過少）或保存過程中蒸發，會導致目標物質濃度被高估（因溶劑減少）；而溶血、脂血樣本（如紅細胞破裂釋放血紅蛋白）會稀釋目標物，造成濃度低估。
二、樣本基質干擾：抑制檢測反應或產生背景信號
樣本中除目標物外的其他成分（基質）可能通過物理或化學作用干擾檢測體系，尤其在未充分提純的樣本中更明顯。
PCR抑制劑：
血液中的血紅蛋白、膽紅素，土壤中的腐殖酸，植物樣本中的多酚類物質等，會通過螯合Mg²?（PCR酶輔因子）、吸附DNA聚合酶或直接破壞核酸結構，抑制擴增反應。例如，未純化的全血樣本直接擴增時，常出現Ct值延遲或擴增曲線異常（如平臺期提前）。
熒光淬滅或增強：
某些基質成分（如深色色素、高濃度鹽離子）會吸收或散射激發光，導致熒光信號被淬滅（信號偏低）；而脂質顆粒可能非特異性結合熒光染料（如SYBRGreen），產生背景熒光（假陽性信號）。
非特異性結合：
在熒光免疫檢測中，樣本中的雜蛋白可能與抗體交叉反應，或吸附在檢測孔表面，導致背景信號升高，降低檢測特異性。
三、樣本前處理缺陷：引入誤差或污染
前處理（如提取、純化、稀釋）是樣本質量控制的關鍵環節，操作不當會放大誤差。
提取效率低：
核酸/蛋白提取時若裂解不充分（如組織未徹底勻漿），會導致目標物回收率低，測量值低于真實值；而離心不徹底殘留的雜質（如細胞碎片）會堵塞光路或干擾反應。
交叉污染：
處理多個樣本時，若移液器污染、耗材重復使用或環境中存在擴增產物氣溶膠，會導致樣本間交叉污染，出現假陽性結果（尤其是qPCR檢測低豐度目標時）。
稀釋誤差：
高濃度樣本需稀釋至檢測線性范圍內，若稀釋倍數計算錯誤或混合不均，會導致結果偏離真實值（如10倍稀釋操作失誤變為5倍，結果被高估1倍）。
四、樣本均一性差：導致重復檢測結果波動
樣本本身的物理不均一會使平行實驗間差異增大，尤其對固體或半固體樣本影響顯著。
組織樣本異質性：
腫瘤組織中癌細胞分布不均，若取樣位置不同，目標基因（如癌基因）的表達量可能差異顯著，導致重復檢測的Ct值標準差增大（通常要求平行樣Ct值差＜0.5，否則結果不可靠）。
懸浮樣本沉淀：
細胞懸液、細菌培養液若未充分混勻，取樣時目標物濃度隨時間變化，會導致平行孔間信號差異超過允許范圍（如CV值＞5%）。
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